6、AT1R 信号转导通过 RhoA 介导 MAF 激活
?接下来，作者想确定 RAS 抑制如何导致 MAF 激活减少。体外用氯沙坦或卡托普利处理 MAF 表明 LOX 和 COL1A1 mRNA 表达降低（图A-B）。p-MLC2 在 RAS 抑制后也显着减少（图C-D）。氯沙坦和卡托普利治疗显着降低了 ARHGEF1 的酪氨酸磷酸化，并导致活性 RhoA 减少（图E-H）。类似地，ARHGEF1 的敲低导致 p-MLC2 减少，支持血管紧张素-ARHGEF1-RhoA 轴在 MAF 中的作用（图I-J）。总的来说，我们结果表明 RAS 通路抑制剂通过抑制 MAF 主动收缩（图K）以及减少胶原蛋白生成和交联来阻止基质硬化，从而改善肿瘤纤维化过程。
7、RAS 抑制增加了贝伐单抗的抗血管生成作用
?基质硬度不受单独贝伐单抗治疗的影响（图A-B）。在 Bev-组中，与非 RAS 治疗的高血压患者和无高血压患者相比，抗 RAS 治疗导致组织硬度降低（图A，C）。类似地，在 Bev 组中，在抗 RAS 治疗的患者中也观察到了相同的基质硬度降低（所有p＜0.001）（图A，D）。此外，抗 RAS 治疗组的硬度降低与特定治疗无关。单独的贝伐单抗治疗不影响 LM 内的 COL-I、aSMA 和 p-MLC2。为了评估抗血管生成治疗（贝伐珠单抗治疗）和RAS 抑制对血管系统的综合影响，我们测量了一大群 CRC LM 中的血管密度。与 Bev-组相比，Bev+组的血管密度显着降低了48.7%± 8.2%。然而，与非RAS、Bev+治疗相比以及与所有 Bev-组。这与使用的 RAS 治疗类型无关。因此，抗 RAS 药物靶向组织硬度，从而影响贝伐单抗的疗效。
8、通过 RAS 和血管生成抑制减少 EC 增殖
? EC 增殖随硬度增加而增加，VEGF 进一步诱导增殖，低硬度时 VEGF 效应最高（图A-C）。此外，我们分析了在不同密度的纤维蛋白原基质（刚度的代表）中存在或不存在 VEGF 的情况下 EC 发芽。EC发芽（芽的数量和长度）随密度增加。VEGF 导致在所有条件下进一步发芽，VEGF 在软基质中的作用更显着，如 EC 增殖的情况。
?为了了解抗 RAS 药物和贝伐单抗的组合如何影响转移灶内的 EC，我们量化了它们对 EC 增殖的影响。单独的贝伐单抗治疗导致 EC 增殖减少 56.1%±11.0%。由于转移僵硬与独立于治疗的转移内的 EC 增殖相关，我们评估了 RAS 抑制是否足以减少 EC 增殖。在未接受抗血管生成治疗的患者中，RAS 抑制并未显着降低 EC 增殖；然而，在接受贝伐单抗和抗 RAS 药物治疗的患者中，EC增殖进一步降低了 78.1%±9.2%）。
9、RAS 和血管生成抑制改善血管完整性
?有趣的是，VEGF 和基质硬化都有效地导致血管通透性。为了进一步表征抗 RAS 药物对血管完整性的作用，我们通过对紧密连接蛋白 ZO-1（封闭小带1）进行免疫染色分析了它们对EC 连接稳定性的影响。虽然建议贝伐单抗治疗导致消除未成熟血管，但我们观察到贝伐单抗对 ZO-1 紧密连接没有变化（图A-B）。与之前在其他疾病模型中的发现一致，即增加基质刚度可增强内皮通透性，我们还观察到 ZO-1 覆盖率与 CRC LM 的组织硬度之间存在负相关，表明在更硬的 LM (图C)。在接受抗 RAS 药物治疗的 Bev-患者中，我们还观察到 EC 中 ZO-1 覆盖率的增加，表明单独的抗 RAS 足以改善内皮连接稳定性（图A，D）。然而，在联合治疗（Bev+和抗 RAS）中，对连接稳定性的影响大大增强（图A，E）。
? KLF2 是一种剪切应力响应转录因子，其表达随层流剪切应力增加，是灌注的标志。抗血管生成治疗没有改变内皮细胞中 KLF2 的表达（图F-G）。然而，KLF2 表达与组织刚度呈负相关，表明基质硬度增加会损害灌注（图H）。在未接受贝伐珠单抗治疗的患者中，KLF2 表达未因抗 RAS 治疗而改变（图F-I），但在抗 RAS 和贝伐单抗治疗的患者中显着更高（图F、J）。
10、内皮细胞YAP/TAZ 是受 LM 基质硬度和VEGF 调节的中枢
?然后我们使用EC 核标记 ERG1 分析了患者样本中的 EC YAP/TAZ 激活状态。抗血管生成治疗导致 YAP/TAZ EC 硬度降低（图K，L），表明 VEGF 信号是 LM 中 EC 中 YAP/TAZ 易位所必需的。然而，与非高血压患者以及接受贝伐珠单抗和非 RAS 药物治疗的患者相比，贝伐珠单抗治疗同时停用 VEGF 的同时降低僵硬度降低了核 YAP/TAZ 强度（图K，N），与 RAS 抑制的类型无关。最相关的是，我们观察到接受 LM 切除术并在疾病过程中接受抗血管生成治疗并同时进行抗 RAS 治疗的患者的 OS 显着延长。这通过多变量 Cox 回归分析得到证实（图O）。综上所述，抗血管生成治疗联合RAS抑制显着抑制内皮 YAP/TAZ 激活和转移性血管生成。
?研究优点：
①肿瘤受到其微环境的机械特性的影响。利用患者样本和原子力显微镜，我们发现肝转移瘤的组织硬度高于原发性结直肠肿瘤。高度活化的转移相关成纤维细胞增加了组织的硬度，从而增强了血管生成和抗血管生成治疗的抵抗力。
②针对肾素-血管紧张素系统的药物通常用于治疗高血压，可抑制成纤维细胞收缩和细胞外基质沉积，从而减少肝转移瘤硬化，并增加贝伐单抗的抗血管生成作用。
③接受贝伐单抗治疗的患者在同时接受肾素-血管紧张素抑制剂治疗时存活时间延长，这突显了调节治疗方案的机械微环境的重要性。
?研究局限性：
①对于接受贝伐单抗治疗的结直肠癌和肺癌患者，贝伐单抗治疗本身就能诱发高血压。在该研究中并未对与贝伐单抗无关的高血压及贝伐单抗导致的高血压进行区分。
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